利用超臨界流體色譜技術(shù)對(duì)甲霜靈對(duì)映體進(jìn)行分離及純化
來(lái)源：沃特世公司 發(fā)布時(shí)間：2015-12-09
農(nóng)藥公司對(duì)于殺蟲(chóng)劑單一對(duì)映體的功效極為關(guān)注。然而，要研究單一異構(gòu)體的作用，首先必須分離對(duì)映體。必要的制備分離技術(shù)對(duì)于我們研究手性殺蟲(chóng)劑單一異構(gòu)體的立體選擇性來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，因?yàn)槲覀冃枰捎眠@些技術(shù)來(lái)分離得到單一的立體異構(gòu)體。
雖然傳統(tǒng)的分離方法主要采用液相色譜(LC)，但是近年來(lái)人們也逐漸開(kāi)始采用超臨界流體色譜(SFC)來(lái)代替正相LC，將手性純化從半制備級(jí)別放大至千克級(jí)。由于超臨界流體具有高擴(kuò)散性和低粘度，SFC可實(shí)現(xiàn)比正相HPLC快3-8倍的分離速度，從而顯著提升工作效率。與正相LC相比，SFC還具有獨(dú)特的選擇性，有機(jī)溶劑消耗量更少、廢液產(chǎn)生量更低、采集體積更小以及純化后干燥時(shí)間更短等優(yōu)點(diǎn)。因此總的來(lái)說(shuō)，SFC是一種更加經(jīng)濟(jì)高效且環(huán)境友好的制備型色譜技術(shù)。SFC純化方法開(kāi)發(fā)的第一步是開(kāi)發(fā)優(yōu)化固定相和流動(dòng)相的分析方法。采用Waters ACQUITY UPC²系統(tǒng)可快速完成該步驟，接下來(lái)即可使用Investigator SFC系統(tǒng)對(duì)開(kāi)發(fā)的方進(jìn)行放大，用于后續(xù)的制備純化。
面對(duì)嚴(yán)格的任務(wù)期限和預(yù)算限制，農(nóng)藥公司研發(fā)和推出新產(chǎn)品的壓力與日劇增，這一結(jié)合了SFC技術(shù)優(yōu)勢(shì)的全新工作流程無(wú)疑是理想之選。甲霜靈是一種苯基酰胺類(lèi)殺菌劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中有一個(gè)手性中心(圖1)，它的殺菌活性主要來(lái)自于R對(duì)映體。在此應(yīng)用紀(jì)要中，我們采用ACQUITY UPC²系統(tǒng)對(duì)甲霜靈進(jìn)行手性分離，然后采用Investigator SFC系統(tǒng)將該方法放大為半制備級(jí)別的純化。
圖1. 甲霜靈對(duì)映異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)。星號(hào)代表立體中心。
實(shí)驗(yàn)方法
儀器
在配備PDA檢測(cè)器的ACQUITY UPC²系統(tǒng)上采用215 nm的波長(zhǎng)進(jìn)行分析，在Investigator SFC系統(tǒng)上進(jìn)行半制備純化。系統(tǒng)組成如下：流體輸送模塊(FDM)、自動(dòng)反壓調(diào)節(jié)器(ABPR)、Alias自動(dòng)進(jìn)樣器、10端口Analytical-2-Prep柱溫箱、2998 PDA檢測(cè)器、補(bǔ)充泵、六位餾分收集模塊。此系統(tǒng)由ChromScope軟件控制。
樣品制備
外消旋(R, S)-甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich(美國(guó)密蘇里州圣路易斯)。用甲醇分別配制1 mg/mL和20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液用于分析進(jìn)樣和制備進(jìn)樣。
分析色譜法
分析分離采用Chiralpak IA-3(4.6 x 150 mm, 3 µm)色譜柱。
結(jié)果與討論
SFC純化的第一步通常是對(duì)多個(gè)手性固定相和流動(dòng)相進(jìn)行梯度篩選。確定了對(duì)樣品對(duì)映選擇性最高的色譜柱條件和溶劑條件之后，需要將梯度方法轉(zhuǎn)換為等度分離法。ACQUITY UPC²系統(tǒng)具有多色譜柱切換功能，提供四種共溶劑選擇。采用這種技術(shù)可縮短分析時(shí)間，從而快速完成方法開(kāi)發(fā)過(guò)程。采用IA-3色譜柱分離對(duì)映體獲得了最高的分離度(圖2)。因此我們選擇了該色譜柱來(lái)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
圖2. 采用IA-3色譜柱的UPC² PDA提取波長(zhǎng)色譜圖(215 nm)。
為了在制備型SFC上進(jìn)行重迭進(jìn)樣以提高分析效率，我們必須采用等度分離條件。開(kāi)發(fā)適當(dāng)?shù)牡榷确椒〞r(shí)，我們需要認(rèn)真考慮分離度和運(yùn)行時(shí)間這兩個(gè)會(huì)影響總體分析效率且互為競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的因素。一般來(lái)說(shuō)，共溶劑百分比越大，運(yùn)行時(shí)間越短，但分離度也越低。此外，大體積進(jìn)樣也會(huì)影響制備色譜法的分離度。要建立成功的等度方法，我們往往需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定合適的運(yùn)行時(shí)間與分離度，使二者達(dá)到平衡。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)，含4%共溶劑的等度洗脫液更適合分析級(jí)分析。
放大
分析級(jí)分析與半制備級(jí)分析的參數(shù)差異主要來(lái)自于所用色譜柱顆粒的粒徑不同(3 μm和5 μm)，以及所用系統(tǒng)(UPC²和Investigator系統(tǒng))的系統(tǒng)體積不同。我們根據(jù)這些差異對(duì)運(yùn)行參數(shù)進(jìn)行了相應(yīng)調(diào)整，從而確定合適的分離度、上樣量以及運(yùn)行次數(shù)。
我們采用10-mm I.D. x 150 mm的IA色譜柱進(jìn)行了上樣量研究，以確定制備分析運(yùn)行的最大上樣量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。我們采用的進(jìn)樣體積為20 µL、40 µL和80 µL。上樣體積為80 µL時(shí)，甲霜靈對(duì)映體仍能獲得良好的分離效果。因此，該方法的單次最大有效上樣量為80 µL或1.60 mg(換算為質(zhì)量)。
圖3. (R, S)-甲霜靈的SFC色譜圖，采用10-mm I.D.IA色譜柱，進(jìn)樣體積分別為20 µL、40 µL和80 µL，樣品濃度為20 mg/mL。
重迭進(jìn)樣能夠在不影響色譜效率的前提下提高分析效率。圖4展示了(R, S)-甲霜靈(20 mg/mL)五次重迭進(jìn)樣的SFC色譜圖，每次進(jìn)樣80 L濃度為20 mg/mL的外消旋溶液。五次重迭進(jìn)樣共耗時(shí)20分鐘，純化得到了8 mg對(duì)映體(每種對(duì)映體4 mg)。溶劑總用量為20 min x 8% x12 mL/min = 約19 mL。由于色譜分析條件為等度條件，我們?cè)谇耙淮芜M(jìn)樣的色譜分析尚未完全結(jié)束時(shí)即進(jìn)行下一次進(jìn)樣，這樣就使得前一次進(jìn)樣的最后一個(gè)峰與隨后進(jìn)樣洗脫出的第一個(gè)峰鄰近。此外，大體積進(jìn)樣也會(huì)影響制備色譜法的分離度。通過(guò)上述連續(xù)進(jìn)樣法所得的色譜圖中，色譜峰排布緊湊，充分說(shuō)明該方法能夠極大節(jié)省分析時(shí)間和溶劑。ChromScope軟件可對(duì)進(jìn)樣和收集間隔進(jìn)行管理，從而有效地預(yù)測(cè)和收集餾分。
圖4. (R, S)-甲霜靈樣品五次重迭進(jìn)樣的SFC色譜圖。陰影區(qū)域代表收集到的餾分，紅色三角形是進(jìn)樣標(biāo)記。
我們采用UPC²等度分析法分析收集到的兩種餾分，以確認(rèn)樣品純化結(jié)果，所得的色譜圖如圖5所示。兩種餾分的純度均>99%。然后采用市售甲霜靈-M((R)異構(gòu)體)標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)確認(rèn)其絕對(duì)構(gòu)型。
圖5. 所收集餾分的分析級(jí)SFC色譜圖，對(duì)映體純度>99%。
結(jié)論
我們將外消旋甲霜靈作為模型化合物，采用Investigator SFC系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)單個(gè)平臺(tái)上的手性分離和純化，是應(yīng)對(duì)此類(lèi)分析挑戰(zhàn)的強(qiáng)大分析工具。采用ACQUITY UPC²系統(tǒng)進(jìn)行的手性篩選可快速確定用于分離R-和S-甲霜靈的最佳色譜柱。此外，我們還開(kāi)發(fā)出了一種等度方法充分發(fā)揮重迭進(jìn)樣的優(yōu)勢(shì)，且該方法還能在維持分離度，保持合理運(yùn)行次數(shù)以及最大上樣量等合理原則的前提下輕松進(jìn)行放大。采用SFC技術(shù)的重迭進(jìn)樣可實(shí)現(xiàn)24 mg/h的純化效率，獲得高純度的甲霜靈對(duì)映體餾分，而其有機(jī)溶劑消耗量遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)LC純化的有機(jī)溶劑消耗量。采用更長(zhǎng)的重迭進(jìn)樣系列還可獲得更多的純化產(chǎn)物。通過(guò)結(jié)合UPC²與Investigator SFC系統(tǒng)，我們成功驗(yàn)證了將SFC應(yīng)用于手性篩選、方法開(kāi)發(fā)、放大以及采用重迭進(jìn)樣的小規(guī)模純化制備時(shí)的完整工作流程，可完全滿(mǎn)足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的快速手性分離需求。該工作流程溶劑消耗量更少、干燥時(shí)間更短，可顯著提高實(shí)驗(yàn)室分析通量，同時(shí)降低單個(gè)樣品的處理成本。